Abstracto
Se han investigado nanopartículas de oro para diversas aplicaciones biomédicas en diagnóstico, teranóstica y como sistemas de administración de fármacos. Al conjugarse con fluoróforos, su interacción con células biológicas puede estudiarse in situ y en tiempo real mediante microscopía de fluorescencia. Sin embargo, una cuestión importante que aún no se ha resuelto es si el fluoróforo es un indicador fiable de la ubicación de la nanopartícula. En este trabajo, nuestra microscopía óptica de mezcla de cuatro ondas, desarrollada recientemente, se aplica para obtener imágenes de nanopartículas de oro individuales y, a su vez, investigar su colocalización con fluoróforos dentro de las células. Nanopartículas de 10 nm a 40 nm de diámetro se conjugaron con transferrina marcada con fluorescencia, para su internalización mediante endocitosis mediada por clatrina, o con anticuerpos marcados con fluorescencia no dirigidos. Se obtuvieron imágenes de células humanas (HeLa) y murinas (3T3-L1) en diferentes momentos tras la incubación con estos conjugados. Nuestra técnica identificó que, en la mayoría de los casos, la fluorescencia se originaba a partir de fluoróforos libres, en lugar de fluoróforos unidos a nanopartículas. La detección de fluorescencia también se vio gravemente limitada por el fotoblanqueo, la extinción y la autofluorescencia de fondo. Cabe destacar que la microscopía correlativa de extinción/fluorescencia de partículas individuales sobre una superficie de vidrio indicó que las estructuras comerciales contienen grandes cantidades de fluoróforos libres. Estos hallazgos resaltan los posibles problemas de interpretación de datos cuando se confía únicamente en la detección de fluorescencia dentro de la célula, y son de gran importancia en el contexto de la microscopía correlativa de luz y electrones.
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