Abstracto
Cuando la obtención de imágenes en vivo no es factible, la fijación de la muestra permite preservar la ultraestructura de las muestras biológicas para su posterior análisis microscópico. Este proceso puede realizarse mediante diversos métodos, cada uno de los cuales afecta de manera diferente la estructura biológica de la muestra. Si bien estas alteraciones se han caracterizado bien mediante microscopía tradicional, existe poca información sobre los efectos de los fijadores en la orientación molecular espacial del tejido biológico. Abordamos este problema empleando microscopía de dispersión Raman anti-Stokes coherente con polarización rotatoria (RP-CARS) para estudiar los efectos de diferentes fijadores en el orden molecular submicrométrico y la morfología micrométrica de la mielina. RP-CARS es una técnica novedosa derivada de la microscopía CARS que permite analizar la orientación espacial de los enlaces moleculares manteniendo la selectividad química intrínseca de la microscopía CARS. Al caracterizar los efectos de los procedimientos de fijación, el presente trabajo constituye una guía útil para la elección de la(s) mejor(es) técnica(s) de fijación, en particular para la microscopía CARS con resolución de polarización. Finalmente, demostramos que la combinación de paraformaldehído y glutaraldehído puede emplearse eficazmente como fijador para la microscopía RP-CARS, siempre que se tengan en cuenta los efectos sobre la distribución espacial molecular, aquí caracterizados.
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